Hospital das Clínicas FMUSPDivisão deAnatomia Patológica
Manual de patologia mamáriaRoteiros para formulação de laudos

Parte I · Fundamentos e macroscopia · Capítulo 2

Macroscopia, processamento e fase pré-analítica

O resultado de um receptor hormonal, de um HER2 ou de um Ki-67 começa a ser decidido antes de a peça chegar ao laboratório. Este capítulo reúne o que cada etapa, do centro cirúrgico à inclusão em parafina, exige do técnico e do patologista, e o que precisa constar no laudo.

2.1Por que a fase pré-analítica importa

A imuno-histoquímica dos biomarcadores mamários é uma medida semiquantitativa: o laudo informa porcentagem de células e intensidade de marcação, e essas grandezas decidem o tratamento. Elas dependem diretamente de como o tecido foi preservado. As diretrizes ASCO/CAP para receptores hormonais e para HER2 tratam o manuseio do tecido como requisito obrigatório do teste, e não como recomendação acessória1,2.

≤ 1 h
entre a retirada da peça e a imersão no fixador3
6–72 h
de fixação em formol tamponado a 10% para RE, RP e HER21,2
1 : 20
proporção tecido : fixador recomendada pelo consenso de 20083
5–10 mm
intervalo das fatias para o formol penetrar na peça1,2

As três fases de um teste imuno-histoquímico

  • Pré-analítica: tempo de isquemia fria, tipo de fixador, tempo de fixação, espessura das fatias, processamento, armazenamento de blocos e lâminas. É a fase em que ocorre a maior parte dos falsos negativos evitáveis.
  • Analítica: recuperação antigênica, clone do anticorpo, sistema de detecção, controles (capítulo 11).
  • Pós-analítica: interpretação, escore e redação do laudo (capítulos 12 a 14).

2.2Tipos de espécime

Cada tipo de espécime tem um objetivo diferente e, portanto, prioridades macroscópicas diferentes. O quadro abaixo resume o que é crítico em cada um.

EspécimeObjetivo principalPontos críticos na macroscopia
Biópsia por agulha grossa (core)Diagnóstico e biomarcadores pré-operatóriosImersão imediata no formol; registrar a hora; contar e medir os fragmentos; incluir todo o material. É o espécime preferido para RE, RP, HER2 e Ki-671,5.
Exérese de nóduloDiagnóstico de lesão palpávelMedir a lesão nas três dimensões; avaliar o aspecto da superfície de corte; representar a interface com o tecido adjacente.
Setorectomia com localização (agulhamento)Retirar lesão não palpável ou microcalcificaçõesRadiografia do espécime; manter as agulhas como referência; garantir que a área radiológica foi amostrada9.
Cirurgia conservadora (quadrantectomia, ressecção segmentar)Tratamento com preservação da mamaOrientação pelos reparos do cirurgião; tinta por margem; medir a distância do tumor a cada margem8.
MastectomiaTratamentoLocalizar o tumor por quadrante ou posição horária e distância ao mamilo; avaliar pele, mamilo e margem profunda (fáscia ou músculo)8.
Linfonodo sentinela e linfadenectomiaEstadiamento axilarContar todos os linfonodos; seccionar em fatias de cerca de 2 mm; incluir todo o tecido nodal14.

2.3Do centro cirúrgico ao formol

O intervalo entre a retirada da peça e o início da fixação é o tempo de isquemia fria. Durante esse período o tecido sofre autólise e os antígenos começam a se degradar. Por isso as diretrizes exigem que a peça seja seccionada e colocada no fixador o mais rápido possível, e que os horários fiquem registrados1,3.

Etapa 1
Retirada da peça
registrar a hora

Peças de local remoto devem ser seccionadas pelo tumor e enviadas imersas em formol1.

Etapa 2
Isquemia fria
≤ 1 hora

Orientar, pintar as margens e fatiar a peça antes da fixação3.

Etapa 3
Fixação
6 a 72 horas

Formol tamponado a 10%, em volume suficiente, com gaze entre as fatias1,3.

Etapa 4
Processamento
≤ 37 °C

Processador convencional; parafina a no máximo 60 °C; formol do processador sempre renovado3.

Penetrar não é fixar

Um erro comum é supor que fragmentos pequenos fixam mais depressa. O formol penetra rapidamente em amostras finas, mas a reação química de fixação (formação de pontes entre proteínas) é lenta e leva praticamente o mesmo tempo em uma biópsia por agulha e em uma fatia de 2 a 3 mm3. Uma biópsia retirada do formol cedo demais continua, na prática, fixada pelo álcool do processador, e responde de modo imprevisível à recuperação antigênica padronizada3.

Tempo necessário para completar a reação química de fixação

A penetração é rápida (uma fatia de 4 mm é penetrada em cerca de 1 hora, uma de 1 cm em cerca de 4 horas); a reação demora muito mais.

0 h15 h30 h45 h60 hMonocamada de células24 hFatia de 4 mm25 hFatia de 1 cm50 h

Dados citados no consenso de Yaziji e colaboradores, 20083.

Requisitos de manuseio para RE, RP, HER2 e Ki-67

  • Fixador: somente formol tamponado a 10% (formaldeído a 4%, pH 7,0–7,4). Outro fixador exige validação própria com pelo menos 100 amostras3.
  • Tempo: de 6 a 72 horas1,2. O consenso de 2008 recomenda pelo menos 8 horas, idealmente de 24 a 48 horas; o tempo no processador conta como fixação se o formol do processador for novo3.
  • Fatias: a intervalos de 5 a 10 mm, depois da inspeção macroscópica e da marcação das margens1,2.
  • Horário de corte: cada laboratório deve definir a hora limite para colocar peças no processador; o que chega depois fica em formol novo durante a noite3.
  • Controle interno: quando o tumor é bem visível, retirar uma fatia de 2 mm de tumor com tecido mamário normal no mesmo cassete, para servir de controle nos testes de biomarcadores3.
  • Lâminas brancas: não usar lâminas cortadas há mais de 6 semanas1.

2.4Tempo de fixação e imunorreatividade

Goldstein e colaboradores fixaram fatias de 24 carcinomas fortemente positivos para RE por tempos controlados, de 3 horas a 7 dias, e mediram a marcação pelo escore Q (0 a 7, soma de intensidade e proporção)4. Com 3 horas de fixação, tumores que eram francamente positivos pareceram fracos ou negativos. A marcação só estabilizou a partir de 6 a 8 horas.

Escore de RE conforme o tempo de fixação em formol

24 carcinomas invasivos RE-positivos, clone 1D5. Com a recuperação antigênica mais curta (25 min), a fixação prolongada também passou a reduzir o sinal.

Recuperação antigênica de 40 min (protocolo padrão)Recuperação antigênica de 25 min
Janela ASCO/CAP: 6 a 72 h012345673 h6 h8 h10 h12 h1 dia2 dias7 diasEscore Q médio (0–7)Tempo de fixação em formol tamponado a 10%2,465,756,76,76,76,76,76,6

Adaptado de Goldstein et al., 20034, tabelas 1 e 2.

Biópsias fixadas por pouco tempo

Na mesma instituição, as biópsias por agulha que deram RE negativo com peça cirúrgica positiva tinham ficado em média 1,2 hora em formol; as concordantes, 6,3 horas4.

Ki-67 é ainda mais sensível

O índice de Ki-67 cai com fixadores diferentes do formol tamponado, com atrasos de 16 horas ou mais antes da fixação e com fixação curta demais (3 horas) ou longa demais (14 dias). O antígeno também se degrada com o armazenamento prolongado do bloco5.

2.5Biópsia por agulha ou peça cirúrgica?

A biópsia por agulha costuma ter isquemia mais curta e fixação mais uniforme do que a peça cirúrgica. Por isso as diretrizes a preferem para os biomarcadores, desde que seja representativa1,5. Ela também é, muitas vezes, o único material disponível antes da quimioterapia neoadjuvante.

Concordância entre biópsia por agulha e peça cirúrgica

353 pacientes, agulha 16G guiada por ultrassom. RE e RP comparados em três categorias (<1%, 1–10%, >10%).

0%25%50%75%100%Receptor de estrógeno92,9%HER2 (0–1+, 2+, 3+)89,3%Tipo histológico84,4%Grau nuclear81,3%Receptor de progesterona77,9%

Adaptado de Tamaki et al., 20106.

O que aconteceu com os 127 casos diagnosticados como carcinoma ductal in situ na biópsia

Quatro em cada dez tinham componente invasivo na peça cirúrgica; 63,5% desses focos invasivos eram pequenos (T1mi ou T1a).

Confirmado CDIS na peça: 75 (59%)Invasivo na peça: 52 (41%)

Adaptado de Tamaki et al., 20106, tabela 1.

≥ 4
fragmentos: número mínimo sugerido; com quatro fragmentos a concordância diagnóstica chegou a 100%6
+5,3 pontos
diferença mediana do Ki-67, mais alto na biópsia do que na peça (30 pacientes, 17 laboratórios)7

Quando repetir o teste na peça cirúrgica

  • Tumor da peça com tipo histológico ou grau diferente do visto na biópsia, pela possibilidade de heterogeneidade1,2.
  • Dúvida sobre o manuseio da biópsia: isquemia longa, pouco tempo em formol ou fixador diferente2.
  • Resultado negativo considerado inesperado pelo patologista, com suspeita de erro de teste2.
  • Para o Ki-67, a recomendação é testar na biópsia, que reflete melhor o estado biológico do tumor7,5.

2.6Orientação, tintas e margens

A avaliação das margens depende da orientação feita pelo cirurgião (fios, clipes) e da pintura de cada superfície com uma cor diferente antes de qualquer corte. Cada margem próxima deve ser medida ao microscópio e a distância informada no laudo, em milímetros. Quando o cirurgião envia ampliações de margem em separado, elas passam a ser as margens definitivas8.

Recidiva local conforme o estado da margem

Metanálise de 33 estudos e 28.162 pacientes tratadas com cirurgia conservadora. Razão de chances de recidiva local; 1 = risco da margem negativa.

00,511,522,53Margem negativa (referência)1,0Margem próxima1,74Margem positiva2,44

Adaptado de Houssami et al., 201410, modelo 2.

Uma margem negativa mais larga não reduziu a recidiva de forma significativa

Mesma metanálise. Razão de chances de recidiva local conforme a distância usada para definir "margem negativa", em relação a 1 mm.

00,511,522,531 mm (referência)1,02 mm0,955 mm0,65 (P = 0,21; sem significância)

Adaptado de Houssami et al., 201410, modelo 1.

Carcinoma invasivo

Margem negativa = ausência de tumor na tinta. Margens mais largas não reduzem a recidiva de forma adicional e não justificam, por si só, uma nova cirurgia11,13.

Carcinoma ductal in situ

Margem adequada = pelo menos 2 mm nas pacientes tratadas com cirurgia conservadora e radioterapia. Abaixo de 2 mm, a reabordagem é decisão clínica individual12,13.

2.7Procedimentos ilustrados

Exame intraoperatório

No intraoperatório o objetivo é orientar a cirurgia: confirmar a lesão, avaliar margens e decidir sobre ampliações. Os desenhos a seguir mostram a sequência para os três cenários mais comuns. O exame intraoperatório do linfonodo sentinela é tratado no capítulo 9.

Desenho em três etapas: setor mamário com área tingida por nanquim, setor com duas agulhas sobre placa radiológica, e faca seccionando o espécime.
Figura 2.1 Procedimento anatomopatológico intraoperatório dos setores mamários excisados por lesões não palpáveis.
  1. ATingimento com tinta nanquim para demarcação designada de margens (utilizando-se várias cores, se necessário).
  2. BEncaminhamento ao exame radiológico com agulhas de calibres diferentes para localização de lesões microcalcificadas.
  3. CSecção seriada em fatias de 2 a 3 mm para identificação de eventual alteração macroscópica.
Desenho de cirurgia conservadora: identificação de margens e raspado, secção seriada, coleta de raspado citológico e corte por congelação.
Figura 2.2 Procedimento anatomopatológico intraoperatório nas cirurgias conservadoras de mama.
  1. AIdentificação das margens e raspado dos afloramentos externos de parênquima mamário.
  2. BSecção seriada em fatias de 2 a 3 mm.
  3. CColeta de raspado citológico da lesão principal e das margens cirúrgicas; corte histológico por congelação das áreas suspeitas.
Desenho de nódulo seccionado com raspado citológico em lâmina e fragmento montado para congelação.
Figura 2.3 Procedimento intraoperatório para diagnóstico de carcinomas mamários em exéreses de nódulos.
  1. ASecciona-se o espécime e efetua-se raspado citológico da superfície de corte.
  2. BRealiza-se o corte por congelação de uma representação do nódulo.

Exame no laboratório

Na peça fixada, os cortes seriados permitem localizar o tumor, medir sua distância às margens e escolher os fragmentos. A representação deve incluir o tumor, as margens mais próximas e as regiões em que o parênquima aflora na superfície. Para a fixação, as fatias são feitas a intervalos de 5 a 10 mm1,2; os cortes finos de 2 a 3 mm servem para identificar lesões pequenas e escolher os fragmentos.

Desenho de peça de cirurgia conservadora: demarcação com nanquim, cortes seriados e representação do tumor e das margens em cassetes.
Figura 2.4 Procedimento anatomopatológico nas peças cirúrgicas provenientes de cirurgias conservadoras de mama, em laboratório.
  1. ADemarcação de margens com tinta nanquim.
  2. BCortes seriados com espessura de 2 a 3 mm.
  3. CRepresentação do tumor e regiões marginais, principalmente aquelas em que o parênquima mamário aflora na superfície. Havendo retalhos de pele, estes devem ser representados também.
Desenho de mastectomia em seis etapas, do corte inicial e coleta de fragmentos até a representação esquemática do corte seriado.
Figura 2.5 Procedimento anatomopatológico nas peças cirúrgicas provenientes de cirurgias radicais de mama, em laboratório.
  1. ACortes iniciais e manuseio da peça cirúrgica para colheita de fragmentos.
  2. BProcessamento e transferência para lâminas.
  3. CLâminas preparadas para exame citológico ou histológico.
  4. DIdentificação e fixação de estruturas anatômicas com auxílio de instrumentos (como tesouras cirúrgicas).
  5. ESecção seriada do parênquima mamário com marcações indicativas.
  6. FRepresentação esquemática do corte seriado com inclusão de fragmentos para análise laboratorial.
Desenho do tecido adiposo axilar sendo dissecado com tesoura e seccionado, com linfonodos identificados na superfície de corte.
Figura 2.6 Procedimento anatomopatológico do produto de linfadenectomia axilar: dissecção dos linfonodos e inclusão.

2.8Microcalcificações e linfonodos

Microcalcificações

  • Confirmar pela radiografia do espécime que as calcificações-alvo estão na peça9.
  • Amostrar de modo que a lesão responsável pelas calcificações seja examinada ao microscópio9.
  • No laudo, relacionar as calcificações radiológicas com a lesão encontrada9.
  • Se houve biópsia prévia, amostrar e documentar o local da biópsia9.

Linfonodos

  • Seccionar cada linfonodo em fatias de cerca de 2 mm, para não deixar de ver macrometástases (> 2 mm)14.
  • Contar e incluir todos os linfonodos dissecados (figura 2.6).
  • A imuno-histoquímica não é necessária de rotina; ajuda em casos selecionados, como carcinoma lobular ou após quimioterapia14.
  • Definições de macrometástase, micrometástase e células tumorais isoladas: capítulo 9.

2.9Roteiro do laudo macroscópico

Os itens abaixo seguem os elementos do conjunto de dados do ICCR para carcinoma invasivo e as exigências de registro das diretrizes ASCO/CAP. Os marcados como essencial são o mínimo para o laudo; os marcados como recomendado são desejáveis8,1.

Dados para laudo anatomopatológico · Fase pré-analítica

As diretrizes ASCO/CAP exigem que esses dados sejam registrados na requisição ou no laudo1.

Hora da retirada da peça essencialInformada pelo centro cirúrgico ou pela radiologia.
Hora de imersão no fixador essencialPermite calcular o tempo de isquemia fria.
Tipo de fixador essencialFormol tamponado a 10%; se outro, informar.
Duração da fixação essencialEm horas, até o início do processamento.
Dados para laudo anatomopatológico · Descrição macroscópica

Elementos derivados do conjunto de dados ICCR8.

Procedimento cirúrgico essencialBiópsia, setorectomia com localização, cirurgia conservadora, mastectomia, linfonodo sentinela etc.
Lateralidade essencialMama direita ou esquerda; em tumores bilaterais, um laudo por lado.
Dimensões e peso do espécime recomendadoTrês dimensões em milímetros; peso em gramas.
Orientação essencialReparos do cirurgião e código de cores das tintas por margem.
Localização do tumor essencialQuadrante ou posição horária e distância ao mamilo.
Número de focos essencialÚnico ou múltiplos; tamanho de cada foco é recomendado.
Tamanho macroscópico essencialMaior dimensão em milímetros, a ser correlacionada com o tamanho microscópico e de imagem.
Distância às margens essencialMargem mais próxima e distância de cada margem.
Pele, mamilo e plano profundo essencialUlceração, nódulos satélites, retração; fáscia ou músculo presentes.
Radiografia do espécime recomendadoPresença das calcificações-alvo e local das agulhas.
Legenda dos blocos essencialCorrespondência entre cada cassete e a região amostrada.

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Manual de patologia mamária · Dr. Roberto Falzoni · Capítulo 2. Ilustrações de macroscopia: acervo do autor.