Imuno-histoquímica: princípios e controle de qualidade

11.1Um ensaio que mede, não só detecta

No diagnóstico, a imuno-histoquímica responde se uma proteína está presente. Nos biomarcadores da mama ela precisa dizer quanto: a porcentagem de núcleos marcados para RE e RP, a intensidade e a completude da membrana para HER2, o índice de Ki-67. Pequenas diferenças de técnica deslocam o resultado de um lado para o outro do ponto de corte. A diretriz ASCO/CAP de 2010 estimou que até 20% das determinações de RE e RP no mundo podiam estar erradas, por falsos negativos ou falsos positivos, na maior parte por variações pré-analíticas e analíticas¹.

até 20%

das determinações de RE e RP possivelmente incorretas (estimativa de 2010)¹

> 20%

dos tumores RE-negativos no laboratório local mostraram alguma expressão na revisão central¹

200

laboratórios de 26 países no programa britânico de qualidade (UK NEQAS) avaliado por Rhodes⁴

Laboratórios que demonstraram adequadamente o RE, conforme o nível de expressão do tumor

UK NEQAS: o mesmo conjunto de cortes enviado a 200 laboratórios. Nos tumores de expressão intermediária e alta, mais de 80% acertaram; no de expressão baixa, só 37%.

Adaptado de Rhodes et al., 2000⁴. As barras de 80% indicam o limite inferior relatado ("mais de 80%").

Onde mora o falso negativo

No tumor de expressão baixa, cerca de um terço dos laboratórios não registrou nenhuma marcação e outro terço só marcação mínima: taxa de falso negativo estimada entre 30% e 60%. A causa foram diferenças pequenas de método, corrigíveis com ajuste fino da técnica⁴. Os tumores de expressão baixa são justamente os que testam a sensibilidade do ensaio.

11.2Clones e plataformas

Diferentes anticorpos contra o mesmo antígeno não têm o mesmo desempenho. As diretrizes exigem que o ensaio usado tenha sido validado contra um método clinicamente validado, isto é, um teste cujo resultado já foi correlacionado com a resposta ao tratamento em estudos clínicos^1,2.

Alvo	Clones e ensaios citados	Observações
Receptor de estrógeno	6F11, 1D5, SP1 (monoclonal de coelho), coquetel 1D5 + ER-2123	SP1 foi mais sensível que 1D5 com a mesma especificidade⁵. O coquetel 1D5 + ER-2123 teve 99% de concordância com os ensaios validados por Allred⁶.
Receptor de progesterona	PgR 1294, 1A6, PgR 312, SP2	A diretriz de 2010 associou a taxa de falso positivo de RP acima de 10% em estudos centrais à baixa especificidade de um clone de coelho então recente (SP2)¹.
HER2	HercepTest (policlonal A0485), 4B5, SP3, CB11	SP3 teve concordância com FISH semelhante à do HercepTest, com maior especificidade e maior poder de discriminação⁸.

SP1 versus 1D5 para receptor de estrógeno

4.105 carcinomas em microarranjo de tecidos, seguimento mediano de 12,4 anos; sensibilidade e especificidade em relação ao ensaio bioquímico (carvão-dextrano).

SP11D5

Adaptado de Cheang et al., 2006⁵.

Os casos discordantes contam a história

Os 8% de tumores positivos com SP1 e negativos com 1D5 tiveram boa evolução, como os RE-positivos; os 2% negativos com SP1 e positivos com 1D5 tiveram evolução ruim. Na análise multivariada, SP1 foi melhor fator prognóstico independente⁵.

SP3 versus HercepTest para HER2, comparados com FISH

179 carcinomas invasivos. O poder de discriminação mede a separação entre casos positivos e negativos, sem cair na faixa duvidosa.

SP3HercepTest

Adaptado de Wludarski e Bacchi, 2008⁸.

Kornaga e colaboradores compararam os ensaios prontos para uso de RE de três fabricantes de plataformas automatizadas (Dako, Leica e Ventana) na mesma coorte tratada com tamoxifeno. Todos tiveram desempenho prognóstico semelhante e comparável ou superior ao do antigo ensaio bioquímico. O ensaio da Leica teve valor preditivo negativo menor. Os casos RE-negativos e RP-positivos não se repetiram entre as plataformas, o que sugere artefato⁷.

11.3Recuperação antigênica e detecção

A fixação em formol forma pontes entre proteínas que mascaram os epítopos. A recuperação antigênica pelo calor desfaz parte dessas ligações e é a etapa que mais interage com o tempo de fixação⁹. No estudo de Goldstein, o protocolo padrão usava tampão EDTA 0,001 mol/L, pH 8, a 95 °C por 40 minutos. Ao encurtar a recuperação para 25 minutos, a fixação prolongada também passou a reduzir o sinal; com 40 minutos, o sinal permaneceu estável de 8 horas a 7 dias (capítulo 2, seção 2.4)⁹.

Por que a recuperação deve ser calibrada

A maioria dos laboratórios otimiza a recuperação antigênica para um tempo de fixação determinado. Tecido subfixado é, na prática, fixado pelo álcool e responde de forma imprevisível ao protocolo padrão³. Padronizar a fixação é o que permite padronizar a recuperação.

Sistema de detecção

A maior parte dos ensaios usa sistemas de avidina-biotina ou de polímero; a diaminobenzidina (DAB) continua sendo o cromógeno mais usado nas reações com peroxidase³. Qualquer troca de sistema de detecção exige revalidação².

Esquema: antígeno sobre a lâmina, anticorpo primário ligado ao antígeno, anticorpo secundário ligado ao primário e polímero com várias moléculas de corante. — **Figura 11.1** Reação imuno-histoquímica amplificada por polímero. O anticorpo primário reconhece o antígeno no tecido; o anticorpo secundário, ligado a um polímero que carrega muitas moléculas de enzima e cromógeno (corante), multiplica o sinal em cada sítio de ligação. Esquema do autor.

11.4Controles externos e internos

Controle externo

Em toda bateria de reações².
Deve incluir amostras negativas, positivas e com porcentagem baixa de expressão, como a amígdala².
Controles na mesma lâmina são recomendados².

Controle interno

O epitélio mamário normal do próprio corte expressa RE e RP de forma heterogênea e serve de referência em cada lâmina^2,3.
O estado do controle interno deve ser informado nos casos com 0% a 10% de marcação².
Por isso, ao fatiar uma peça, vale incluir tumor e tecido normal no mesmo cassete (capítulo 2)³.

Quando o resultado não pode ser liberado

O caso é considerado não interpretável para RE ou RP se a amostra for inadequada (pouco tumor ou artefatos graves), se os controles externo e interno não marcarem como esperado, ou se fatores pré-analíticos tiverem comprometido o ensaio². A diretriz de 2010 lista ainda: descalcificação com ácidos fortes, fenótipo RE-negativo e RP-positivo, isquemia prolongada ou fixação fora de 6 a 72 horas com resultado negativo e sem controle interno; nesses casos, repetir em outra amostra¹.

11.5Validação e revalidação

Antes de liberar o primeiro resultado clínico, o laboratório precisa demonstrar que seu ensaio reproduz um método clinicamente validado. Depois disso, a qualidade é mantida por controles em cada bateria, reavaliação periódica e participação em programas externos.

90%

concordância mínima nos casos positivos na validação inicial de RE e RP¹

95%

concordância mínima nos casos negativos¹

2×/ano

reavaliação do ensaio, no mínimo semestral²

96%

concordância entre IHQ e FISH para HER2 em 697 casos, após revisão dos discordantes¹⁰

O que exige revalidação

Troca do clone do anticorpo primário².
Novo método de recuperação antigênica ou novo sistema de detecção².
Qualquer mudança significativa no sistema de teste, incluindo fixador diferente do formol tamponado (validação com pelo menos 100 amostras)^2,3.

No estudo de Grimm e colaboradores, a maior parte das discordâncias entre IHQ e FISH para HER2 foi de casos positivos na imuno-histoquímica e negativos no FISH (13 de 19), causados principalmente por interpretação: intensidade fraca lida como forte, marcação granular e leitura em áreas de esmagamento¹⁰. A interpretação de HER2 é detalhada no capítulo 13.

11.6Ensaios de proficiência

O laboratório que faz RE, RP e HER2 deve participar de um programa externo de proficiência com pelo menos duas rodadas por ano. Desempenho satisfatório exige pelo menos 90% de respostas corretas. A diretriz recomenda ainda inspeção presencial a cada dois anos, com autoinspeção anual².

Como os laboratórios pontuaram os mesmos três núcleos de HER2

Pesquisa de proficiência do CAP (HER2-A, 2013), microarranjo de tecidos enviado a mais de 1.000 laboratórios. O núcleo 4 (3+) teve consenso; nos núcleos 5 e 6 houve dispersão entre 0, 1+ e 2+.

Escore 01+2+3+

Dados do relatório aos participantes do CAP, 2013¹³, reproduzidos na aula do autor (2014).

Leitura do gráfico

Mesmo com 95% de acerto no caso fortemente positivo, cerca de 11% a 17% dos laboratórios classificaram como 2+ (equívoco) núcleos que a maioria leu como 0 ou 1+. Em 2013 isso significava encaminhar o caso para ISH. Hoje, com a categoria HER2-baixo, a distinção entre 0 e 1+ também passou a ter consequência terapêutica (capítulo 13).

Concordância entre o laboratório local e o central para RE

Ensaios clínicos com revisão central. Nos estudos IBCSG, o laboratório local usou ensaio bioquímico e o central, imuno-histoquímica. A discordância pesou mais nos casos negativos locais.

Dados compilados na diretriz ASCO/CAP de 2010¹.

11.7Análise de imagem

Sistemas de análise digital quantificam a porcentagem de núcleos positivos e a intensidade média, com o patologista escolhendo as áreas de tumor. Em um estudo multicêntrico com 260 amostras, a análise de imagem foi considerada substancialmente equivalente à leitura no microscópio para RE e RP. O ganho foi maior na intensidade: a concordância entre patologistas no escore de intensidade de RE variou de 55,0% a 86,3% ao microscópio e de 88,8% a 90,0% com análise de imagem¹¹.

Concordância entre patologistas para RE (corte de positividade)

Mesmo conjunto de lâminas, leitura ao microscópio e com análise de imagem.

Microscopia manualAnálise de imagem

Adaptado de Nassar et al., 2011¹¹.

Para Ki-67, uma plataforma aberta e calibrada (QuPath), aplicada em 17 laboratórios, mostrou correlação muito alta entre cortes consecutivos, sem erro sistemático¹² (capítulo 14).

11.8Dados técnicos no laudo

Dados para laudo anatomopatológico · Informações técnicas do ensaio

Baseado na diretriz ASCO/CAP de 2020² e no conjunto de dados do ICCR¹⁴.

Clone do anticorpo recomendado	Para RE, RP e HER2; elemento recomendado do ICCR.
Plataforma e sistema de detecção recomendado	Útil para comparar resultados entre laboratórios e ao longo do tempo.
Estado do controle interno essencial	Obrigatório quando RE ou RP têm de 0% a 10% de marcação.
Controle externo essencial	Registrado no laboratório para cada bateria; mencionar no laudo quando não há controle interno.
Dados pré-analíticos essencial	Tempo de isquemia fria, fixador e duração da fixação (capítulo 2).
Resultado não interpretável essencial	Informar o motivo: amostra inadequada, controles inadequados ou falha pré-analítica.

Dados para laudo anatomopatológico · Comentário recomendado

Quando não há controle interno e o RE está entre 0% e 10%²:

"Não há controles internos presentes, mas os controles externos estão adequadamente positivos. Se necessário, o teste em outra amostra que contenha controles internos pode ser indicado para confirmar o estado do RE."

Referências

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Allison KH, Hammond MEH, Dowsett M, McKernin SE, Carey LA, Fitzgibbons PL, et al. Estrogen and progesterone receptor testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline update. Arch Pathol Lab Med. 2020;144(5):545-63. doi:10.5858/arpa.2019-0904-SA
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Rhodes A, Jasani B, Barnes DM, Bobrow LG, Miller KD. Reliability of immunohistochemical demonstration of oestrogen receptors in routine practice: interlaboratory variance in the sensitivity of detection and evaluation of scoring systems. J Clin Pathol. 2000;53(2):125-30. doi:10.1136/jcp.53.2.125
Cheang MC, Treaba DO, Speers CH, Olivotto IA, Bajdik CD, Chia SK, et al. Immunohistochemical detection using the new rabbit monoclonal antibody SP1 of estrogen receptor in breast cancer is superior to mouse monoclonal antibody 1D5 in predicting survival. J Clin Oncol. 2006;24(36):5637-44. doi:10.1200/JCO.2005.05.4155
Phillips T, Murray G, Wakamiya K, Askaa J, Huang D, Welcher R, et al. Development of standard estrogen and progesterone receptor immunohistochemical assays for selection of patients for antihormonal therapy. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2007;15(3):325-31. doi:10.1097/01.pai.0000213135.16783.bc
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Manual de patologia mamária · Dr. Roberto Falzoni · Capítulo 11.